圖1 BP-TIDT實驗裝置和雙平面并行檢測光路示意圖

近日，南京理工大學(xué)電子工程與光電技術(shù)學(xué)院陳錢、左超教授課題組提出了一種新型高速、高分辨率三維無標記顯微鏡技術(shù)。該工作以“High-Speed High-Resolution Transport of Intensity Diffraction Tomography with Bi-Plane Parallel Detection”為題發(fā)表在國際頂尖光學(xué)期刊Laser &Photonics Reviews，并當選為期刊封面論文。電光學(xué)院博士生周寧和張潤南，碩士生徐偉勝為本文共同第一作者，南京理工大學(xué)為第一完成單位和通訊單位。

光學(xué)衍射斷層掃描 (ODT) 是一種新興的三維(3D)顯微鏡技術(shù)，利用透明生物樣本的固有折射率 (RI) 作為自然對比機制，實現(xiàn)無標記成像。它能夠以 3D 形式可視化和定量表征此類樣本的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。與傳統(tǒng)熒光成像方法不同，ODT 無需外源熒光染料，避免了光毒性和光漂白等潛在問題。因此，這種非侵入性、無標記的方法已廣泛應(yīng)用于生物物理學(xué)、細胞生物學(xué)、血液學(xué)、微生物學(xué)和神經(jīng)科學(xué)等各個領(lǐng)域，為研究人員提供了生物醫(yī)學(xué)研究和臨床應(yīng)用的有力工具。

基于非對稱照明的非干涉ODT僅需要利用樣品和照明光束之間的相對角度變化在不同條件下捕獲2D強度圖像。隨后使用這些圖像重建標本的3D RI。當照明的數(shù)值孔徑(NA)與物鏡的NA相匹配時，低頻相位分量可以完全轉(zhuǎn)移到強度圖像中。然而，高NA顯微鏡系統(tǒng)在實驗中通常難以嚴格滿足匹配的照明條件，導(dǎo)致在提高ODT的空間分辨率時出現(xiàn)低頻缺失的問題。雖然低頻區(qū)域的相位分量可以通過離焦調(diào)制轉(zhuǎn)移到強度圖像中，但軸向離焦需要在顯微鏡中引入機械運動，限制了它們在生物樣本如活細胞動態(tài)成像中的適用性。因此，在無標記非干涉ODT中獲得高時空分辨率的動態(tài)3D RI重建仍然是一項重大挑戰(zhàn)。

針對上述問題，陳錢、左超研究團隊提出了一種新型的高速、高分辨率非干涉ODT方法 (High-Speed High-Resolution Transport of Intensity Diffraction Tomography with Bi-Plane Parallel Detection，簡稱BP-TIDT)，并搭建了相關(guān)實驗平臺(圖1)。該技術(shù)將雙平面檢測方案與強度傳輸衍射斷層掃描相結(jié)合，在不引入機械位移的情況下補償了低頻下缺失的相位信息，有效地解決了傳統(tǒng)非干涉ODT無法同時實現(xiàn)高時間和空間分辨率的問題。

同時，為了解決傳統(tǒng)迭代求解方法計算時間的消耗，推導(dǎo)了如圖2所示的雙平面?zhèn)鬏敼鈴娧苌鋵游隼碚撃Ｐ停ㄟ^一次反卷積直接求解線性問題，即可得到樣品的3D RI結(jié)果。為了驗證所提出 BP-TIDT 方法的定量 3D RI 重建能力，使用聚苯乙烯微球作為測試樣品進行了實驗，并將結(jié)果與純相微球的模擬進行了比較。實驗結(jié)果與模擬結(jié)果幾乎沒有差異，表明BP-TIDT技術(shù)不需要額外的軸向機械位移就可以有效實現(xiàn)定量RI恢復(fù)，克服了傳統(tǒng)ODT方法在非匹配照明條件下觀察到的重建質(zhì)量下降和RI低估的問題。

圖2.從PTF角度闡述光照條件和離焦相位調(diào)制在非干涉ODT中的重要性，并通過聚苯乙烯微球的仿真和實驗結(jié)果論證BP-TIDT方法的有效性。

圖3展示了BP-TIDT方法與96孔板樣品室兼容性分析，以及高速高分辨率活細胞成像結(jié)果。高通量/高內(nèi)涵成像在生物醫(yī)學(xué)研究中至關(guān)重要，可提供詳細的細胞信息和快速的圖像分析。96 孔板作為高通量/高內(nèi)涵成像中常用的樣品室，設(shè)計有小孔徑和深壁，以維持細胞生長所需的營養(yǎng)豐富的環(huán)境，這會限制光入射角度。圖3所示的96 孔板允許的最大照明 NA 為 0.66。當照明 NA 超過此值時，孔壁會阻擋光束，導(dǎo)致圖像信息丟失。本文提出的 BP-TIDT 方法克服了非干涉 ODT 技術(shù)中固有的匹配照明條件，使高 NA 物鏡(例如 40× 0.95 NA)在高通量/高內(nèi)涵成像中的應(yīng)用成為可能，從而顯著提升成像分辨率。

如圖3(c) 所示，BP-TIDT技術(shù)結(jié)合96孔培養(yǎng)皿用于 COS-7 細胞的高速、高分辨率 3D RI成像。該圖像顯示了分裂過程中的 COS-7 細胞，具有兩個細胞核。在細胞分裂期間，細胞兩極的胞吞作用很明顯，這是一個高能量需求的時期。這個過程對于細胞的能量和物質(zhì)攝入調(diào)節(jié)至關(guān)重要。此外，作為細胞的能量來源，線粒體在低能量需求下采用細長的形狀以提高代謝效率，并在細胞分裂期間變得更短更圓以滿足增加的能量需求。研究結(jié)果表明，所提出的方法對藥物篩選和分子生物學(xué)研究等應(yīng)用特別有益。該技術(shù)通過更快的速度和更高的分辨率促進對生物樣本的詳細體積分析，加速了科學(xué)發(fā)現(xiàn)。

圖3 BP-TIDT方法與96孔板樣品室兼容性分析及成像結(jié)果

上述工作得到了國家重大儀器專項、國家自然科學(xué)基金、江蘇省基礎(chǔ)研究計劃前沿引領(lǐng)專項、江蘇省青年基金項目、中央高校科研專項資助項目以及江蘇省光譜成像與智能感知重點實驗室開放基金的支持。

審核編輯 黃宇